2.2.6細(xì)胞形態(tài)

　　24 h后，在硼硅玻璃蓋上培養(yǎng)的細(xì)胞在PBS 1X中沖洗3次，并在4%的PFA中室溫固定10分鐘。在PBS 1X中沖洗3次，在0.1%v/v Triton-X100 (ThermoFisher，美國)的PBS 1X中室溫滲透15分鐘。通過在室溫下將細(xì)胞浸泡在3%w/v的牛血清白蛋白(BSA, Sigma Aldrich，美國)PBS 1X中1小時(shí)，使特異性抗原位點(diǎn)飽和。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架染色方法是在室溫黑暗環(huán)境下，在Dylight 488 (ThermoFisher Scientific，美國)偶聯(lián)Phalloidin中孵育1小時(shí)。ɑ-tubulin的免疫標(biāo)記首先通過與單克隆小鼠抗ɑ-tubulin抗體(SantaCruz Biotechnology，美國)在室溫下雜交1小時(shí)進(jìn)行，然后與與Dylight 550偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體(ThermoFisher Scientific)在室溫下雜交1小時(shí)進(jìn)行。如上所述，用Hoechst 33,342染色核。

　　2.2.7培養(yǎng)上清液中鈣的熒光劑量

　　在粉末提取物中細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，并根據(jù)制造商在黑色96孔板(康寧，美國)中的說明，使用商業(yè)熒光劑量法(Abcam，英國)測定鈣的劑量。熒光在平板閱讀器(flustar Optima, BMG Labtech，德國)中測量，激發(fā)為544 nm，發(fā)射為590 nm。

　　2.2.8顯微圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　對于每個(gè)需要進(jìn)行顯微鏡觀察的實(shí)驗(yàn)，使用垂直AxioImager M2熒光顯微鏡與AxioCam MRm相機(jī)(Zeiss，德國)耦合成像至少10個(gè)場。然后使用ImageJ軟件對圖像進(jìn)行分析。通過計(jì)數(shù)Hoechst 33,342個(gè)陽性核來測量細(xì)胞密度，反映細(xì)胞數(shù)量，并報(bào)告為細(xì)胞數(shù)/cm2。增殖率計(jì)算為EdU陽性核占Hoechst 33,432個(gè)陽性核的百分比。

　　對于每個(gè)測試，至少進(jìn)行了3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，使用新鮮制備的粉末提取物。使用GraphPad Prism 9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否正常。根據(jù)數(shù)據(jù)集和正態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunn 's事后檢驗(yàn)(非參數(shù))，或者進(jìn)行ANOVA單向檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)。p≤0.05為差異顯著。

　　2.2.6細(xì)胞形態(tài)

　　24 h后，在硼硅玻璃蓋上培養(yǎng)的細(xì)胞在PBS 1X中沖洗3次，并在4%的PFA中室溫固定10分鐘。在PBS 1X中沖洗3次，在0.1%v/v Triton-X100 (ThermoFisher，美國)的PBS 1X中室溫滲透15分鐘。通過在室溫下將細(xì)胞浸泡在3%w/v的牛血清白蛋白(BSA, Sigma Aldrich，美國)PBS 1X中1小時(shí)，使特異性抗原位點(diǎn)飽和。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架染色方法是在室溫黑暗環(huán)境下，在Dylight 488 (ThermoFisher Scientific，美國)偶聯(lián)Phalloidin中孵育1小時(shí)。ɑ-tubulin的免疫標(biāo)記首先通過與單克隆小鼠抗ɑ-tubulin抗體(SantaCruz Biotechnology，美國)在室溫下雜交1小時(shí)進(jìn)行，然后與與Dylight 550偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體(ThermoFisher Scientific)在室溫下雜交1小時(shí)進(jìn)行。如上所述，用Hoechst 33,342染色核。

　　2.2.7培養(yǎng)上清液中鈣的熒光劑量

　　在粉末提取物中細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清液，并根據(jù)制造商在黑色96孔板(康寧，美國)中的說明，使用商業(yè)熒光劑量法(Abcam，英國)測定鈣的劑量。熒光在平板閱讀器(flustar Optima, BMG Labtech，德國)中測量，激發(fā)為544 nm，發(fā)射為590 nm。

　　2.2.8顯微圖像分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　對于每個(gè)需要進(jìn)行顯微鏡觀察的實(shí)驗(yàn)，使用垂直AxioImager M2熒光顯微鏡與AxioCam MRm相機(jī)(Zeiss，德國)耦合成像至少10個(gè)場。然后使用ImageJ軟件對圖像進(jìn)行分析。通過計(jì)數(shù)Hoechst 33,342個(gè)陽性核來測量細(xì)胞密度，反映細(xì)胞數(shù)量，并報(bào)告為細(xì)胞數(shù)/cm2。增殖率計(jì)算為EdU陽性核占Hoechst 33,432個(gè)陽性核的百分比。

　　3結(jié)果與討論

　　3.1生蠔殼粉的表征

　　SEM分析提供了OSP顆粒的顯微照片。圖1A在高倍放大下顯示了具有典型外棱柱狀殼層或片狀殼層的粒子表面的細(xì)節(jié)。它們一般以牡蠣殼的生長方向?yàn)閷?dǎo)向(Yoon et al.， 2003)。表面不規(guī)則，有大量碎屑，如短礦物纖維，如圖1B所示。顯示了所選粉末顆粒的整體形貌和尺寸。

　　對于每個(gè)測試，至少進(jìn)行了3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，使用新鮮制備的粉末提取物。使用GraphPad Prism 9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否正常。根據(jù)數(shù)據(jù)集和正態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunn 's事后檢驗(yàn)(非參數(shù))，或者進(jìn)行ANOVA單向檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)。p≤0.05為差異顯著。

　　對OSP樣品進(jìn)行了能量色散X射線分析(EDS)。鈣(36.09%)、氧(47.25%)、碳(14.43%)的存在*為明顯。鎂(0.71%)、鈉(1.53%)、硅(1.53%)等元素也微量存在。這些元素可以取代碳酸鹽中的鈣。

　　圖2A。顯示原始OSP的X線圖。方解石是粉末的主要礦物成分(JCPDS N°47-1743)。沒有文石相，其他多態(tài)生物碳酸鹽被檢測到。原始樣品中銳利的衍射峰的存在表明高結(jié)晶度(菱形顯微結(jié)構(gòu)- r 3ˉm空間群)。

　　FT-IR特征波段為1403.92 cm?1,873.59 cm?1,711.60 cm?1(圖2B)。1403.92 cm?1和873.59 cm?1分別對應(yīng)ν3-不對稱CO3拉伸和ν1不對稱CO3變形。711.73 cm?1歸因于ν4對稱CO3形變。873.59 cm?1和711.60 cm-1帶與方解石參考振動(dòng)帶密切匹配(Gunasekaran等人，2006;Rujitanapanich et al.， 2014)，并確認(rèn)了方解石中生蠔殼粉的組成。輕微的變化可能歸因于雜質(zhì)和/或碳酸鹽基團(tuán)的變形。

　　圖2C顯示了對原始OSP進(jìn)行TGA/DTA的結(jié)果。樣品中存在的有機(jī)物和濕度在150°C到200°C之間被去除。DTA曲線所示的吸熱反應(yīng)記錄在700°C到820°C之間。通過CaCO3→CaO+CO2的反應(yīng)，觀察到CaCO3的煅燒分解為CaO↑(Choi et al.， 2011;哈桑·馬哈茂德等人，2015;Cudrado and Rica, 2017)。這一測量證實(shí)了牡蠣殼粉的化學(xué)成分。